淋巴毒实验
微量淋巴细胞毒试验技术(Microcytotoxicity Assay)自1964年美国Terasaki等引入HLA分型研究后,几经改良,于1970年被美国国立卫生研究院(NIH)指定为国际通用的标准技术。这一技术是研究HLA系统的基本试验方法。该方法由于仅用1ul抗血清、1ul淋巴细胞、1ul补体、1小时孵育时间,使抗原、抗体和补体结合,故称之为“快速微量淋巴细胞毒实验方法”。
基本原理:淋巴细胞膜表面具有HLA抗原,在补体的作用下HLA特异性抗体(IgG或IgM)与淋巴细胞膜上相应的HLA抗原结合,激活补体,从而改变了细胞膜的通透性,即细胞膜破坏打洞,采用染色法着色,染料进入到死细胞中,而以细胞死亡的数目来判断抗原、
抗体反应的强度。死亡细胞数与反应强度成正比。如淋巴细胞不带有相应的抗原,则无此作用。
一、实验室配置
1、 荧光倒置显微镜,推荐:
Olympus 进口 1台
2、 连续加样器:
1微升六通道加样器 进口 1 支
5微升六通道加样器 进口 1 支
1微升单通道加样器 进口 1 支
5微升单通道加样器 进口 1 支
3、 磁力架:
12孔磁力架 进口 1个
4、 其他必备设备
冰箱 1台
离心机 1台
恒温水浴箱 1台
5、试剂和相应耗材
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 冻干一类补体 |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 冻干二类补体 |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 抗淋巴细胞阳性质控血清 |
阴性质控试剂 | 阴性质控血清 |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 免疫磁珠T细胞分离剂-2.5ml |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 免疫磁珠T细胞分离剂-10ml |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 免疫磁珠B细胞分离剂-2.5ml |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 免疫磁珠B细胞分离剂-10ml |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 免疫磁珠T细胞加速剂 |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 冲洗磁珠用缓冲液 |
HLA抗原分型试剂盒(血清学法) | 一步法荧光终止剂 |
泰萨奇板(标准)-72孔 | Terasaki空板-72孔 |
单克隆抗体检测试剂 | 羊抗人IgG |
矿物油 | 用于密封反应体系 |
二、实验操作步骤:
细胞分离
1. 取2ml供者的抗凝血或100ul白膜(抗凝剂最好选择枸橼酸钠即ACD)。
2. 用淋巴细胞分离液(国产、进口均可)或荧光免疫磁珠(ONE LAMBDA)。
3. 分离细胞后用McCoy’s液或RPMI1640培养液悬浮细胞,细胞数为:大约2000个/ul.
血清制备:
4. 无抗凝剂添加的试管取受者5ml外周血。
5. 用水平式离心机离心2000rpm,10分钟,收集血清。
补体制备:
6. 将ONE LAMBDA公司的一类补体,用无菌水(4℃冷藏后最佳)充分溶解(如有条件可将溶解中的试管置于冰浴中)。
7. 完全溶解后分装(10-20ul/管),-20℃下储存备用。
注:这里只是ONE LAMBDA公司的补体效价结果,如使用其他补体不能保证结果,切忌反复冻融补体。
实验步骤:
8. 准备一块TERASAKI空板。
9. 取供者淋巴细胞1ul,受者血清1ul,OLI一类补体1ul及5ul矿物油,分别加入空板孔中,加盖放入37℃水浴箱中孵育1小时。
阴性对照 | 细胞对照 | 补体对照 | 样品孔1 | 样品孔2 | 阳性对照 | |
供体细胞 | 1ul | 1ul | 1ul | 1ul | 1ul | 1ul |
受体血清 | 1ul | —— | —— | 1ul | 1ul | —— |
阳性血清(ATG) | —— | —— | —— | —— | —— | 1ul |
补体 | —— | —— | 1ul | 1ul | 1ul | 1ul |
1640培养液 | 1ul | 2ul | 1ul | —— | —— | —— |
矿物油 | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul | 5ul |
注:ALSG为ONE LAMBDA公司标准的阳性对照。
附:对照孔设置:
阳性对照:细胞+ALSG+补体
阴性对照:细胞+血清+McCoy’s液或RPMI1640培养液
补体对照:细胞+补体+McCoy’s液或RPMI1640培养液
细胞对照:细胞+McCoy’s液或RPMI1640培养液
10. 1小时后取出反应板,在反应孔中再加入5ul荧光终止剂,加入终止剂后即可在镜下观察。
判定分数以NIH方法为准,按照死细胞所占比例来定。
结果判定:
显微镜下死细胞呈红色,活细胞呈绿色,镜下用细胞计数器计数,算出死细胞与活细胞的比例,以百分比计算。
三、评分标准:
死细胞比例 | 评分 | |
阴性 | 1-10% | 1 |
阴性 | 11-20% | 2 |
阴性/阳性 | 21-50% | 4 |
阳性 | 51-80% | 6 |
阳性 | 81-100% | 8 |
四、实验注意事项
1. 如果得到血液后同一天就分离白细胞,那么是可以用肝素钠或ACD的。
2. 严禁使用肝素锂。
3. 肝素钠本身是粉末,使用时必须同血液充分混匀(颠倒10次),否则会引起细胞裂解。
4. 如果第二天才准备分离白细胞,ACD会更好一些。ACD含有白细胞新陈代谢所需的葡萄糖。第一天用肝素或ACD的收益是一样的,但2-5天后,ACD的收益会更好一些。
5. 请在室温下斜置储存血液。不要使用管架垂直存放血液。垂直存放血液会形成白膜层,所有的细胞都会集结在一个区域。在白膜层所有的营养物质会引起细胞的新陈代谢变化,细胞收益就会减少。血液应该斜置储存,这样细胞就会平均分布在整个管中。
6. OLI不建议使用EDTA。EDTA之所以是抗凝剂是因为它可以凝结凝血酶原转化至凝血酶所必需的钙离子。凝血酶可导致纤维蛋白凝结从而构成凝血块。EDTA还会凝结补体中的钙离子,阻断细胞毒素。血液加入到EDTA以前一般都是血清学上这么做的,但是EDTA必须完全去除,否则就会妨碍或削弱后续反应。EDTA对抗原表达无影响.